RNA幹擾。
RNA幹擾。
盡管之前已經描述了相關程序[37,38],但使用成年寄生蟲進行的RNAi實驗是基於針對血吸蟲優化的方法[39]。
雖然之前已經描述過該程序[37,38],但成蟲寄生蟲RNAi(核糖核酸幹擾)實驗是基於日本血吸蟲幼蟲的優化方法[39]。
簡而言之,體外培養的寄生蟲在第65-438+0-3天以及此後每隔5-6天用新加入的20-30mg dsRNA浸泡。
簡而言之,體外培養的寄生蟲在1-3天用新加入的20-30 mg雙鏈RNA浸泡,之後每隔5-6天加入壹次。
作為陰性對照,用含有pJC53.2插入片段的ccdB和camR合成的dsRNA浸泡動物(參考。29).
用含有pjc53.2添加劑的ccdB和camR合成的雙鏈RNA浸泡動物作為陰性對照(參考文獻29)。
如前所述進行dsRNA合成[29]。用於產生dsRNAs的序列在補充圖9中提供。
雙鏈RNA的合成如前所述進行[29]。產生雙鏈RNA的序列見補充圖9。
為了測量mRNA水平,來自對照和敲除寄生蟲(8個雄性後部體細胞片段)的總RNA被逆轉錄(iScript cDNA合成試劑盒,Bio-Rad ),並且在Applied Bio-systems Step One Plus儀器上使用GoTaq qPCR Master Mix with SYBR green(Promega)進行定量實時PCR。
為了測定mRNA(信使RNA)水平,對對照和解體寄生蟲中的總RNA(8個陽性後體片段)進行逆轉錄(BioRad synthesis kit),使用含有SYBR green kit的GoTaq定量聚合酶鏈反應(qPCR)超混包,在應用生物系的儀器上進行實時定量聚合酶鏈反應(PCR)。
轉錄水平被標準化為蛋白酶體β亞單位4型(smp_056500)的mRNA水平。
轉錄水平根據4型蛋白酶體β亞單位(smp_056500)的mRNA水平進行標準化。
使用Step One Plus軟件中的DDCt計算來計算相對量。寡核苷酸引物序列列於補充表3。
相對量用Step One Plus軟件中的DDCt計算方法計算。寡核苷酸的基本序列列於補充表3。