1.1 ?1代分子標記
1.1.1 ?RFLP標簽技術。
Botesin在1980提出的限制性片段長度多態性(RFLP)可作為遺傳標記，開創了DNA多態性直接應用的新階段，是最早的分子標記技術。RFLP是檢測限制性內切酶消化後形成的特定DNA片段的大小，反映DNA分子上不同限制性位點的分布。因此，DNA序列的微小變化，甚至是65，438+0個核苷酸的變化，也能引起限制性內切酶切割位點的丟失或產生，導致限制性內切酶片段長度的變化。
優點:RFLP標記的等位基因具有* * *顯性的特點，結果穩定可靠，重復性好，特別適合構建遺傳連鎖圖譜。
缺點:在RFLP分析中，需要該位點的DNA片段作為探針，放射性同位素和核酸雜交技術既不安全也不容易自動化。此外，RFLP對DNA多態性檢測不敏感，在RFLP連鎖圖上有許多大的空間區域。
1.1.2 ?RAPD標記技術。
為了克服RFLP技術的缺點，Williams在1990建立了隨機擴增多態性DNA (RAPD)技術。由於其獨特的檢測DNA多態性的方式，RAPD技術迅速滲透到基因研究的各個領域。RAPD是壹種基於PCR的分子標記技術。基本原理是用壹個隨機引物(8 ~ 10堿基)通過PCR反應隨機擴增DNA片段，然後用凝膠電泳分離擴增片段，研究DNA多態性。對於任何特定的引物，在基因組DNA序列中都有其特定的結合位點。壹旦基因組在這些區域有DNA片段插入、缺失或堿基突變，這些特異性結合位點的分布就可能發生變化，從而導致擴增產物的數量和大小發生變化，表現出多態性。
優點:與RFLP相比，RAPD技術簡單，檢測快速，DNA消耗少，實驗設備簡單，無需DNA探針，設計引物時無需預克隆、標記或序列分析，不受物種特異性和基因組結構的影響。壹套合成的引物可用於不同生物的基因組分析，壹條引物可擴增多個片段，不需要同位素，安全性好。
缺點:當然RAPD技術受多種因素影響，實驗的穩定性和重復性較差。首先是顯性遺傳，不能識別雜合子位點，使得遺傳分析相對復雜。在基因作圖和連鎖遺傳作圖中，由於顯性覆蓋，計算基因座間遺傳距離的準確性屬於特異性和基因組結構。壹套引物可以用於不同生物的基因組分析，壹條引物可以擴增多個片段，而且不需要同位素，安全。當然，RAPD技術受多種因素影響，實驗的穩定性和可重復性較差。首先是顯性遺傳，不能識別雜合子位點，使得遺傳分析相對復雜。在進行基因作圖和連鎖遺傳作圖時，由於顯性覆蓋，計算基因座間遺傳距離的準確性會降低。其次，RAPD對反應條件非常敏感，包括模板濃度和Mg2+濃度，因此實驗的可重復性較差。
1.3 ?AFLP標記技術
？擴增片段長度多態性(AFLP)又稱選擇性限制性片段擴增2 (SRFA)，由荷蘭KEYGENE公司的Zabean和Vos於1993年發明，並已申請專利。AFLP是近年來發展迅速的壹種分子標記技術。它將基因組DNA經成對限制性內切酶消化後的片段與壹個接頭(與限制性位點互補)連接起來，通過5’端與接頭互補的半特異性引物擴增大量DNA片段，從而形成指紋的分子標記技術。AFLP指紋是孟德爾顯性和隱性遺傳。
優點:兼有RAPD和RFLP的優點，穩定性高。用少量的選擇性引物可以在短時間內檢測到大量的基因座，每對引物檢測到的許多基因座或多或少隨機分布在多條染色體上。每條染色體上AFLP標記的數量與染色體長度呈正相關(r = 0。501)，而壹對引物涉及的染色體數與標記數呈正相關(r = 0。因此，可以通過少量高效的引物組合獲得覆蓋全基因組的AFLP標記。目前，AFLP作為壹種高效的指紋技術，在遺傳育種研究中發揮了其優勢。
缺點:但也有研究認為AFLP對基因組純度和反應條件要求較高。此外，當用於遺傳作圖時，少數標記與圖譜的緊密度不同。此外，基於RAPD和RFLP技術，建立了scar(序列表征擴增區)、caps(裂解擴增多態性序列)和daf (DNA am 2擴增指紋)。這些技術的出現，進壹步豐富和完善了1代分子標記技術，增加了人們對DNA多態性的研究手段。
1.2 ?第二代分子標記
2.1 ?SSR標記技術。
真核生物基因組中存在許多非編碼重復序列，如重復單元長度為15 ~ 65個核苷酸的微衛星DNA(重復單元長度為2 ~ 6個核苷酸的小衛星DNA。微衛星和微衛星DNA分布在全基因組的不同位點。由於重復單元的大小和順序不同，拷貝數也不同，構成了豐富的長度多態性。摩爾在1991年結合PCR技術創立了SSR(簡單序列重復)標記技術。SSR又稱微衛星DNA，是壹種由若幹個模體(多為1 ~ 5)串聯重復組成的DNA序列，其中最常見的是二核苷酸重復序列，即(CA) n和(TG) N，每個微衛星DNA的核心序列結構相同，重復單元數為10 ~ 60，其高度多態性主要來源於串聯的數目。不同遺傳物質的重復次數不同導致SSR長度的高度變異性，這是SSR標記的基礎。SSR標記的基本原理:根據微衛星重復序列兩端的特定短序列設計引物，通過PCR反應擴增微衛星片段。由於核心序列重復次數不同，擴增出不同長度的PCR產物，是檢測DNA多態性的有效方法。微衛星序列具有高度多態性，在群體中具有* * *顯性，是壹種很好的分子標記。目前，微衛星標記已被用於構建人類、小鼠、大鼠、水稻、小麥、玉米等物種的染色體遺傳圖譜。
優點:這些微衛星標記已廣泛應用於基因定位與克隆、疾病診斷、遺傳分析或品種鑒定、作物育種、進化研究等領域。此外，SSR標記不僅可以鑒別純合子和雜合子，而且結果更加可靠，方法簡單，省時省力。
2.2 ?ISSR標記技術。
ISSR是壹種新的分子標記技術。1994年，Zietkiewicz發展了SSR技術，建立了錨定微衛星寡核苷酸技術。他們使用錨定的微衛星寡核苷酸作為引物，即在SSR的5’端或3’端添加2 ~ 4個隨機選擇的核苷酸，可以引起特定位點的退火，從而導致與錨定引物互補的重復序列之間基因組片段的PCR擴增。這種標記也被稱為ISSR
序列重復)、assr(錨定簡單序列重復)或AMP2PCR。在使用的雙翼引物中，壹個可以是ASSR引物，另壹個可以是隨機引物。如果壹個是5’端有錨的ASSR引物，另壹個是隨機引物，稱為RAMP技術[19]。ISSR2PCR擴增使用的引物通常是16 ~ 18堿基序列，由1 ~ 4堿基串聯重復序列和幾個非重復錨定堿基組成，從而保證引物與基因組DNA中SSR的5’或3’末端結合，通過PCR反應擴增SSR之間的DNA片段。
優點:SSR在真核生物中的分布非常普遍，進化和突變的速度非常快，所以錨定引物的ISSR2PCR可以檢測基因組中很多位點的差異。與SSR-2 PCR相比，ISSR-2 PCR使用的引物不需要事先進行DNA測序，這也是為什麽有些ISSR引物在特定的基因組DNA中可能沒有配對區域，沒有擴增產物，通常是顯性標記，孟德爾遺傳，具有良好的穩定性和多態性。
1.3 ?第三代分子標記
3.1 ?SNP標記技術。
單核苷酸多態性(單核苷酸？多態性，SNP)被稱為第三代DNA分子標記，是指同壹位點不同等位基因之間單個核苷酸的差異，包括單個堿基的缺失或插入，更常見的是單個核苷酸的取代，常發生在嘌呤堿基(A和G)和嘧啶堿基(C和T)之間。SNP標記可以幫助區分兩個個體之間遺傳物質的差異，被認為是最有前途的遺傳標記。目前，已經在人類染色體上定位了2 000多個標記，在擬南芥中開發了236個SNP標記。大約30%的SNP標記含有限制性位點的多態性。
優點:檢測SNP最好的方法是DNA芯片技術。最新報道的微芯片電泳可以高速檢測臨床樣本中的SNP，比毛細管電泳和平板電泳分別快10和50倍。SNP與1代的RFLP和2代的SSR有兩方面的不同:壹是SNP不再以DNA片段的長度變化作為檢測手段，而是直接以序列變異作為標記；其次，SNP標記分析完全拋棄了經典的凝膠電泳，取而代之的是最新的DNA芯片技術。
3.2 ?EST標記技術。
表達序列標簽(EST)是由美國國立衛生研究院(NIH)的生物學家Venter在1991中提出的。隨著人類基因組計劃的開展，EST技術被廣泛應用於發現新的人類基因、繪制人類基因組圖譜和識別基因組序列編碼區等研究領域，進而被廣泛應用於植物基因組研究。EST是指在不同組織的cDNA文庫中隨機克隆測序，獲得部分cDNA序列。壹個EST對應於某個mRNA的cDNA克隆序列，長度壹般為150 ~ 500 bp，只包含基因編碼區。
優點:EST可以代表壹個生物體在某壹時刻的壹個表達基因，因此被稱為“表達序列鑒定”；然而，ESTs的數量顯示了它所代表的基因的拷貝數。壹個基因表達的次數越多，它的cDNA克隆就越多。因此，通過對cDNA克隆進行測序和分析，可以知道基因的表達豐度。目前壹般采用試劑盒來構建cDNA文庫，DNA測序技術的快速發展使得進壹步降低大規模DNA測序的成本成為可能。